Profilazione circadiana non distruttiva del contenuto di amido nella foglia fresca e intatta di Arabidopsis con due

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 16525 (2022) Citare questo articolo

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I cloroplasti vegetali conducono la fotosintesi per convertire l'energia solare in zuccheri per la fonte di carbonio essenziale per la vita e la crescita delle cellule durante il giorno. Una frazione dei prodotti fotosintetici viene immagazzinata nei cloroplasti formando granuli di amido per continuare a fornire energia di carbonio durante la notte. Attualmente, la profilazione del modello temporale dell'amido richiede: (i) il sacrificio delle foglie o (ii) la generazione di piante transgeniche con il rischio di modificare il metabolismo incorporando un'amido sintasi legata ai granuli geneticamente modificata (GBSS). In questo articolo, abbiamo dimostrato un metodo non distruttivo utilizzando la fluorescenza a due fotoni (TPF) e l'imaging di generazione della seconda armonica (SHG) per quantificare i granuli di amido all'interno dei cloroplasti di foglie fresche intatte durante un ciclo giorno-notte. Lo abbiamo fatto utilizzando due linee di Arabidopsis con contenuto di amido normale ed in eccesso: wild-type (Columbia-0) e amido in eccesso 1 (sex1). I granuli di amido sono stati visualizzati mediante l'imaging SHG, mentre i cloroplasti nelle cellule del mesofillo sono stati visualizzati mediante l'imaging TPF. I nostri risultati hanno fornito una risoluzione spaziale su scala micron della distribuzione dell’amido all’interno delle foglie e hanno mostrato modelli circadiani dell’amido coerenti con quelli profilati dai test enzimatici in studi precedenti. Abbiamo dimostrato che l'imaging TPF-SHG è un potenziale strumento per rivelare l'eterogeneità in tempo reale del ritmo circadiano dell'amido nelle cellule fogliari, senza la necessità di una preparazione distruttiva del campione.

L'amido è la principale riserva di carboidrati nelle piante superiori1. Esistono due luoghi principali in cui viene prodotto l'amido nelle piante. Uno è nelle foglie dove avviene la fotosintesi. L'altro è negli organi di stoccaggio come gli steli e le radici. L'amido negli organi di deposito si accumula continuamente e non viene degradato finché non è necessario per la crescita. L'amido nelle foglie, invece, ha una variazione diurna. Durante il giorno, la fotosintesi produce amido che si accumula nel cloroplasto per poi formare granuli di amido2,3. Quando la fotosintesi cessa di notte, l'energia necessaria per la sopravvivenza e la crescita cellulare è fornita dalla degradazione dell'amido immagazzinato nelle foglie durante il giorno4,5,6. La capacità di monitorare le variazioni immediate dell'amido è importante per monitorare i meccanismi coinvolti nel metabolismo dell'amido.

I metodi comunemente utilizzati per la quantificazione dell'amido comprendono metodi enzimatici7,8, colorazione amido-iodio e modificazione genetica. I metodi enzimatici estraggono e degradano l'amido con enzimi e possono essere utilizzati per quantificare la quantità totale di residuo di glucosio immagazzinato nell'amido9. Il metodo di colorazione con soluzione di iodio utilizza lo iodio per tingere l'amido senza estrarlo dalla foglia. Ma per osservare chiaramente l'amido macchiato, gli zuccheri e la clorofilla devono essere sciolti e rimossi con alcool. Questo metodo consente di determinare la posizione e la distribuzione dell'amido nel tessuto, ma a causa della necessità di sciogliere la clorofilla e colorare con una soluzione di iodio, il metodo distrugge le foglie durante il processo di preparazione. Un altro metodo per la determinazione dell'amido consiste nel clonare un costrutto che contiene un gene bersaglio di interesse, quindi ottenere piante transgeniche che portano il costrutto integrato casualmente nel genoma. Utilizzando un enzima che partecipa al metabolismo dell'amido e fondendolo con una proteina fluorescente si ottiene una pianta transgenica che consente l'osservazione dell'amido attraverso l'imaging fluorescente10,11. Sebbene l'utilizzo dell'imaging delle proteine ​​fluorescenti per l'analisi quantitativa dell'amido non distrugga la foglia transgenica, la creazione di una pianta transgenica è complicata e richiede tempo e deve essere eseguita per ciascun ecotipo di interesse. Un altro metodo non distruttivo utilizzato per quantificare l'amido nelle piante è l'imaging microCT, applicato specificamente al raggio e al parenchima assiale (RAP) negli steli legnosi12. Poiché quest'ultimo metodo non fornisce un contrasto unico con l'amido, si basa sull'utilizzo delle forme e delle dimensioni delle celle RAP ottenute dall'analisi delle immagini e non può essere facilmente applicato in generale per la determinazione dell'amido.