Il sistema eINTACT analizza lo sfruttamento batterico dell'osmosegnalazione delle piante per aumentare la virulenza

Nature Plants volume 9, pagine 128–141 (2023) Citare questo articolo

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I batteri iniettano proteine effettrici nelle cellule ospiti per manipolare i processi cellulari che promuovono la malattia. Poiché i batteri forniscono minuscole quantità di effettori solo nelle cellule ospiti mirate, è tecnicamente difficile catturare i cambiamenti cellulari dipendenti dagli effettori dai tessuti ospiti infetti in massa. Qui, riportiamo una nuova tecnica chiamata isolamento effettore-inducibile di nuclei taggati in tipi cellulari specifici (eINTACT), che facilita la purificazione basata sull'affinità dei nuclei dalle cellule vegetali di Arabidopsis che hanno ricevuto effettori batterici Xanthomonas. L'analisi dei nuclei purificati rivela che l'effettore Xanthomonas XopD manipola l'espressione dei geni correlati alla segnalazione dell'acido abscissico di Arabidopsis e attiva OSCA1.1, un gene che codifica per un canale permeabile al calcio necessario per la chiusura stomatica in risposta allo stress osmotico. La perdita di OSCA1.1 provoca avvizzimento delle foglie e ridotta crescita batterica nelle foglie infette, suggerendo che OSCA1.1 promuove la suscettibilità dell'ospite. eINTACT ci consente di scoprire che XopD sfrutta la chiusura stomatica mediata dall'osmosegnalazione dell'ospite OSCA1.1/acido abscissico per creare un habitat umido che favorisce la crescita batterica e apre una nuova strada per chiarire con precisione le funzioni degli effettori di numerosi batteri vegetali gram-negativi nei nativi contesti di infezione.

Gli agenti patogeni batterici entrano nelle piante ospiti attraverso aperture naturali (ad esempio stomi o idatodi) o ferite e successivamente si moltiplicano nello spazio apoplastico tra le cellule o nei vasi1,2. Per facilitare l'infezione, i batteri gram-negativi virulenti iniettano gli effettori nelle cellule ospiti utilizzando un complesso multiproteico simile a una siringa, il sistema di secrezione di tipo III (T3SS)3. All'interno delle cellule ospiti, gli effettori si localizzano in specifici compartimenti subcellulari e manipolano i processi cellulari dell'ospite per sopprimere l'immunità dell'ospite e/o creare un ambiente che favorisca la crescita o la dispersione dei batteri4,5. Studi recenti sui patogeni batterici suggeriscono che la creazione di uno spazio apoplastico acquoso nelle piante è fondamentale per la virulenza batterica6. Infatti, sono stati identificati alcuni effettori che promuovono la malattia causando un aumento dei livelli di acqua nei tessuti infetti, come Pseudomonas syringae HopM16, Xanthomonas gardneri AvrHah17 e Xanthomonas translucens Tal88. A causa della diversità degli effettori in generi batterici filogeneticamente distinti, i meccanismi molecolari alla base della suscettibilità delle piante mediata dagli effettori rimangono in gran parte enigmatici.

Xanthomonas campestris pv. campestris ceppo 8004 (Xcc8004) è un patogeno vascolare fogliare che provoca il marciume nero in molte colture di Brassica e nella pianta modello Arabidopsis2. Una delle sue proteine effettrici, la proteina esterna D di Xanthomonas (XopDXcc8004, in questo studio, XopD), è una proteina effettrice di tipo III localizzata nel nucleo contenente tre elementi N-terminali specifici per la pianta reattivi all'etilene associati al fattore legante di repressione anfifilica (EAR) motivi che di solito mediano il silenziamento trascrizionale nella pianta e un dominio di proteasi cisteina C-terminale9 (Dati estesi Fig. 1). Curiosamente, due studi precedenti hanno riportato attività distinte di XopD in Arabidopsis10,11. Uno studio ha dimostrato che XopD promuove la malattia sopprimendo la necrosi fogliare precoce, ma non influenza la crescita batterica nelle foglie infette di Arabidopsis10. Attraverso il suo dominio contenente il motivo EAR, XopD interagisce e stabilizza le proteine Arabidopsis DELLA che sono i principali repressori trascrizionali dei geni sensibili all'acido gibberellico (GA)10. Tuttavia, l'interazione XopD-DELLA non causa cambiamenti rilevabili nei livelli delle trascrizioni rispondenti a GA10. Controversamente, un altro studio ha dedotto un effetto di avirulenza di XopD, poiché l'espressione transgenica di XopD sotto il controllo di un promotore inducibile dal β-estradiolo in Arabidopsis ha innescato risposte di difesa dipendenti dall'acido salicilico (SA) e ha soppresso la crescita batterica11. Inoltre, avendo una piccola attività proteasica ubiquitin-like modifier (SUMO), è stato scoperto che XopD, in vitro, interagisce con e deSUMOilato Arabidopsis HFR1, un fattore di trascrizione (TF) coinvolto nella segnalazione del fitocromo11. Nel loro insieme, entrambi gli studi precedenti si prestano a suggerire che XopD potrebbe modulare l’attività dei TF vegetali e le vie di segnalazione del fitormone ospite. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base delle precise funzioni planta di XopD rimangono inconcludenti.

2) enriched biological GO terms. The DEGs that were not annotated by these GO terms were not shown. c, WashU Epigenome Browser snapshots showing mCG and mCHH methylation levels at SUVH9 and OSCA1.1 loci. Positive and negative bars indicate 5-methylcytosine levels of single cytosine on the Watson (+1) and Crick (−1) strands, respectively. The transposable elements (TEs) are shown as grey boxes. The transcription start site (TSS) is indicated with a brown triangle. d,e, The expression levels (mean read counts) of OSCA1.1 (d) and PR1, PR2, PR5, EDS1 and PAD4 (e) in nuc−XopD and nuc+XopD. Data are presented as mean values ± s.e.m. (error bars) from n = 3 independent biological replicates. DESeq2 P values are from Wald test corrected for multiple testing using the Benjamini–Hochberg method (nuc−XopD versus nuc+XopD; OSCA1.1, P = 0.033; PR1, P = 0.819; PR2, P = 0.947; PR5, P = 0.794; EDS1, P = 0.833; PAD4, P = 0.981). *P < 0.05; NS, not significant (P > 0.05). f, Relative expression of XopD, PR1, PR2, OSCA1.1 and HYL1 after XopD was induced by β-estradiol in Arabidopsis seedlings, relative to their expression in DMSO-treated seedlings. The expression of TUB2 is used as a control. Data are presented as mean values ± s.e.d. (error bars) from n = 2 independent biological replicates. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (DMSO-treated seedlings versus β-estradiol-treated seedlings; XopD, P = 0.04; PR1, P = 0.04; PR2, P = 0.03; OSCA1.1, P = 0.42; HYL1, P = 0.15). *P < 0.05; NS, not significant (P > 0.05). Small circles indicate data points of individual biological replicates (d–f)./p> 0.05). b, RT-qPCR analysis of RD29A expression in nuc+XopD relative to its expression in nuc−XopD. The expression of TUB2 is used as a control. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 3 independent biological replicates. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (P = 0.043). *P < 0.05. c, Relative abundances of miR159a in nuc−XopD and nuc+XopD compared to its abundance in total nuclei of mock-inoculated leaves. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 3 independent biological replicates and normalized against the abundances of ACTIN2/8 in each sample. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (nuc−XopD versus nuc+XopD, P = 0.019). *P < 0.05. d, Representative leaves infected with indicated bacterial strains under regular (60%) or high (95%) humidity conditions at seven DPI. Mock, treatment with buffer; ABA, treatment with ABA. e, The water loss rate of detached Xcc* (+XopD) and Xcc∆xopD* (−XopD) infected leaves at seven DPI. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 8 leaves from four different plants. f, A boxplot representing bacterial population density in symptomatic leaf tissues inoculated with Xcc* (+XopD) and Xcc∆xopD* (−XopD) at seven DPI. Horizontal lines from the top show maxima, upper quartile, median, lower quartile and minima values, and cross marks show the mean values. For each treatment, n = 8 leaves from four different plants were examined. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (no treatment: Xcc∆xopD* inoculated leaves versus Xcc* inoculated leaves, P = 0.046; Xcc∆xopD* inoculated leaves: mock treatment versus ABA treatment, P = 0.014). *P < 0.05. Small circles (a–c,f) represent data points of individual biological replicates./p>six-fold) lower in nuc+XopD (Fig. 4c), which coincided with a significant increase in MYB33 expression in these nuclei (Fig. 4a)./p>

5, false discovery rate (FDR) adjusted P value < 0.05, |log2FC| > 1)47./p>96% methylated pUC19 DNA spiked in) was sheared to 100–500-bp fragments using a focused ultrasonicator (Covaris E220 system), in microtubes at a setting of 175 peak incident power, 10 dc, 200 cpb for 40 s. Enzymatic methyl-sequencing (EM-seq) libraries were prepared from sheared DNA using NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit following the manufacturer instructions (New England BioLabs). Due to the amount of starting DNA material being lower than 10 ng, the minimum recommended amount of starting material by the manufacturer, we added two PCR cycles at the final step of PCR amplification of the sequencing libraries. Libraries were sequenced on NovaSeq 6000 system (Novogene) for collecting 2× 150-bp paired-end reads that passed the Illumina quality control filter (Supplementary Table 8)./p>100 bp, mean methylation difference >0.15, test statistic areaStat >10. A locally installed WashU Epigenome Browser was used for visualizing DNA methylation at single-base resolution54./p>2) sample types were analysed by ANOVA followed by post hoc Tukey’s honestly significant difference. Experiments were performed at least twice with similar results./p>

0.05)./p>

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